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顯微鏡

激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)應(yīng)用

發(fā)布日期：2022-10-09 點擊率：71

    　　激光掃描共聚焦顯微鏡（LaserscanningConfocalMicroscopy，簡稱LSCM）是近代生物醫(yī)學(xué)圖象儀器的最重要發(fā)展之一，它是在熒光顯微鏡成象的基礎(chǔ)上加裝激光掃描裝置，使用紫外光或可見光激發(fā)熒光探針，利用計算機進行圖象處理，從而得到細胞或組織內(nèi)部微細結(jié)構(gòu)的熒光圖象，以及在亞細胞水平上觀察諸如Ca2+、pH值、膜電位等生理信號及細胞形態(tài)的變化。已廣泛應(yīng)用于細胞生物學(xué)、生理學(xué)、病理學(xué)、解剖學(xué)、胚胎學(xué)、免疫學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)等領(lǐng)域，對生物樣品進行定性、定量、定時和定位研究具有很大的優(yōu)越性，為這些領(lǐng)域新一代強有力的研究工具。
  
　　創(chuàng)建于1983年的美國Meridian公司，在90年代推出的“激光掃描共聚焦顯微鏡”這一項具有劃時代的義意的高科技產(chǎn)品，曾獲得美國“政府新產(chǎn)品獎”和兩次“高科技領(lǐng)先技術(shù)獎”，它能達到每秒120幅畫面的高速掃描激光共聚焦觀察，可提供實時，真彩色的激光共聚焦原色圖象。我院最近引起的ACASuLTIMA312是Meridian公司最新的高科技產(chǎn)品，為同類儀器中檔次最高、功能最全的精密儀器?，F(xiàn)以該儀器為例介紹激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)及其在細胞生物學(xué)中的應(yīng)用。

　　1、激光掃描共聚焦顯微鏡成像原理及組成 

　　有關(guān)共聚焦顯微鏡的某些技術(shù)原理，早在1957年就已提出，二十年后由Brandengoff在高數(shù)值孔徑透鏡裝置上改裝成功具有高清晰度的共聚焦顯微鏡，1985年WijnaendtsVanResandt發(fā)表了第一篇有關(guān)激光掃描共聚焦顯微鏡在生物學(xué)中應(yīng)用的文章，到了1987年，才發(fā)展成現(xiàn)在通常意義上的第一代激光掃描共聚焦顯微鏡。 

　　激光掃描共聚焦顯微鏡成像原理如圖1所示，激光器發(fā)出的激光束經(jīng)過擴束透鏡和光束整形鏡，變成一束直徑較大的平行光束，長通分色反射鏡使光束偏轉(zhuǎn)90度，經(jīng)過物鏡會聚在物鏡的焦點上，樣品中的熒光物質(zhì)在激光的激發(fā)下發(fā)射沿各個方向的熒光，一部分熒光經(jīng)過物鏡、長通分色反射鏡、聚焦透鏡、會聚在聚焦物鏡的焦點處，再通過焦點處的針孔，由檢測器接收。 

    只有在物鏡的焦平面上發(fā)出的熒光才夠到達檢測器，其它位置發(fā)出的光均不能過針孔。由于物鏡和會聚透鏡的焦點在同一光軸上，因而稱這種方式成像的顯微鏡為共聚焦顯微鏡為共聚顯微鏡。在成像過程中針孔起著關(guān)鍵作用，針孔直徑的大小不僅決定是以共聚焦掃描方式成像還是以普遍學(xué)顯微鏡掃描方式成像，而且對圖像的對比度和分辨率有重要的影響。  

　　ACASULTIMa312采用快速鏡掃描或臺階掃描對樣品逐點掃描成像，由于樣品中不同的掃描點始終在物鏡和會聚透鏡的光軸上，因而它以相同的信噪比掃描整個樣品，掃描精度達0.1μm，掃描面積最大的為10cm×8cm，當激光逐點掃描樣品時，針孔后的光電倍增管也逐點獲得對應(yīng)光點的共聚焦圖像，并將之轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號傳輸至計算機，最終在屏幕上聚合成清晰的整個焦平面的共聚聚焦圖像。一個微動步進馬達控制栽物臺的升降，使焦平面依次位于標本的不同層面上，可以逐層獲得標本相應(yīng)的光學(xué)橫斷面的圖像。這稱為“光學(xué)切片”。再利用計算機的圖像處理及三維重建軟件?？梢缘玫礁咔逦葋肀憩F(xiàn)標本的外形剖面，十分靈活、直觀地進行形態(tài)學(xué)觀察。

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